Pipeline Detail

scRNA-Seq单细胞与空间组学

单细胞高级下游：拟时序、通讯、RNA velocity

面向 scRNA-seq 的高级下游分析流程，覆盖拟时序轨迹、细胞通讯、RNA velocity、起点选择、结果交叉验证和生物学解释。

创建时间

2026/6/3

分析难度

高级

推荐场景

单细胞分析

预计耗时

3-5 天

Metadata

流程元数据

先看应用场景、输入输出和工具依赖，再进入正文命令细节。

Difficulty

高级

Scenario

单细胞分析

Estimated Time

3-5 天

Tools

SeuratMonocle3CellChatscVelo

Inputs

GTF

Outputs

UMAP

Workflow DAG

流程图

用步骤节点快速理解这个分析从原始数据到结果报告的流转关系。

STEP 1

已注释 scRNA-seq 对象

→

STEP 2

选择目标细胞群

→

STEP 3

Monocle3/Slingshot 拟时序

→

STEP 4

CellChat/NicheNet 通讯

→

STEP 5

scVelo RNA velocity

→

STEP 6

多结果交叉验证

→

STEP 7

轨迹/网络/velocity 图

→

STEP 8

机制解释报告

Protocol

流程文档

正文保留 Markdown 排版、代码语言标识和表格样式，适合边学边复现。

单细胞高级下游：拟时序、通讯、RNA velocity

一、适用场景

基础 scRNA-seq 分析得到细胞类型和 marker 后，高级下游用于回答更深入的问题：

分析	主要问题	常用工具
拟时序	细胞是否存在连续状态转换或分化轨迹？	Monocle3、Slingshot、Palantir
细胞通讯	细胞群之间可能通过哪些 ligand-receptor 互作？	CellChat、NicheNet、LIANA
RNA velocity	细胞状态变化方向是什么？	velocyto、scVelo

注意：这些方法都是推断，不能替代实验验证。结果必须结合 marker、样本背景、时间点和已知生物学知识解释。

二、整体流程图

flowchart TD
    A[Seurat/Scanpy 基础分析对象] --> B[选择目标细胞群]
    B --> C[重新降维聚类]
    C --> D[Monocle3 / Slingshot 拟时序]
    C --> E[CellChat / NicheNet 通讯]
    C --> F[velocyto + scVelo RNA velocity]
    D --> G[动态基因与分支基因]
    E --> H[ligand-receptor 网络]
    F --> I[velocity arrows 和 latent time]
    G --> J[交叉验证候选机制]
    H --> J
    I --> J
    J --> K[报告和实验验证候选]

三、拟时序 Monocle3

拟时序适合分析发育、分化、激活、疾病进展等连续状态。

library(monocle3)
library(SeuratWrappers)

target <- subset(seurat_obj, subset = celltype %in% c("Progenitor", "Intermediate", "Mature"))

cds <- as.cell_data_set(target)
cds <- cluster_cells(cds)
cds <- learn_graph(cds)

cds <- order_cells(
  cds,
  root_cells = colnames(cds)[colData(cds)$celltype == "Progenitor"]
)

plot_cells(
  cds,
  color_cells_by = "pseudotime",
  label_cell_groups = FALSE,
  label_leaves = TRUE,
  label_branch_points = TRUE
)

关键点：

起点 root cells 需要根据生物学先验选择。
不要对完全无连续关系的细胞强行做拟时序。
分支点附近基因值得重点关注。

四、拟时序动态基因

deg_pseudo <- graph_test(
  cds,
  neighbor_graph = "principal_graph",
  cores = 4
)

dynamic_genes <- deg_pseudo |>
  dplyr::filter(q_value < 0.05) |>
  dplyr::arrange(q_value)

write.csv(dynamic_genes, "monocle3_pseudotime_genes.csv")

解释示例：

GeneA 在 pseudotime 早期高表达，随后下降，可能标记祖细胞状态。
GeneB 在分支 2 后持续升高，可能参与成熟细胞命运决定。

五、CellChat 细胞通讯

library(CellChat)

data.input <- GetAssayData(seurat_obj, assay = "RNA", slot = "data")
meta <- seurat_obj@meta.data

cellchat <- createCellChat(
  object = data.input,
  meta = meta,
  group.by = "celltype"
)

cellchat@DB <- CellChatDB.human

cellchat <- subsetData(cellchat)
cellchat <- identifyOverExpressedGenes(cellchat)
cellchat <- identifyOverExpressedInteractions(cellchat)
cellchat <- computeCommunProb(cellchat)
cellchat <- filterCommunication(cellchat, min.cells = 10)
cellchat <- computeCommunProbPathway(cellchat)
cellchat <- aggregateNet(cellchat)

netVisual_circle(
  cellchat@net$count,
  vertex.weight = as.numeric(table(cellchat@idents)),
  weight.scale = TRUE,
  label.edge = FALSE
)

图例解释：

元素	含义
节点	细胞类型
节点大小	细胞数量
连线	推断的通讯关系
连线粗细	ligand-receptor 互作数量或强度
方向	sender 到 receiver

六、NicheNet 配体活性分析

NicheNet 适合从 receiver 细胞的差异基因反推 upstream ligands。

# 思路示意：
# 1. 定义 sender cell types
# 2. 定义 receiver cell type
# 3. 找 receiver 中处理组 vs 对照组 DEG
# 4. 用 NicheNet 预测哪些 ligand 最能解释这些 DEG

解释：

如果 macrophage 表达 TGFB1，fibroblast 中 TGF-beta response genes 上调，
NicheNet 可能将 TGFB1 排为高活性 ligand。

七、RNA velocity scVelo

RNA velocity 需要 spliced/unspliced count，通常由 velocyto 或 kallisto|bustools 生成 loom/h5ad。

velocyto run10x   sample_cellranger_output   ref/genes.gtf

import scvelo as scv
import scanpy as sc

adata = scv.read("sample.loom", cache=True)
scv.pp.filter_and_normalize(adata)
scv.pp.moments(adata, n_pcs=30, n_neighbors=30)

scv.tl.velocity(adata, mode="stochastic")
scv.tl.velocity_graph(adata)
scv.pl.velocity_embedding_stream(adata, basis="umap", color="celltype")

scv.tl.latent_time(adata)
scv.pl.scatter(adata, color="latent_time", color_map="gnuplot")

图例解释：

图	读法
velocity stream	箭头方向表示预测状态变化方向
latent time	越大表示越靠近推断终末状态
phase portrait	spliced/unspliced 关系支持基因动态

八、三类结果如何交叉验证

发现	支持证据组合
分化方向	Monocle3 pseudotime 与 scVelo arrows 方向一致
关键调控细胞	CellChat 显示该细胞为强 sender，目标细胞沿拟时序变化
候选 ligand	sender 表达 ligand，receiver 有 receptor 且下游基因随 pseudotime 变化
关键基因	是动态基因、velocity gene，并出现在通路或通讯下游

示例结论：

Monocle3 显示 monocyte 向 macrophage 状态连续过渡，scVelo 箭头方向与该轨迹一致。
CellChat 进一步提示 fibroblast 到 macrophage 的 CSF1-CSF1R 通讯增强。
因此可以假设 fibroblast-derived CSF1 参与推动 macrophage 状态转换。

九、常见问题

问题	可能原因	建议
拟时序方向不合理	root 选择错误或细胞群不连续	根据 marker 和时间点重新选择 root
通讯结果过多	数据库互作多、阈值太宽	关注显著通路和组间变化
RNA velocity 箭头混乱	unspliced 信号弱、细胞周期影响	过滤低质量基因，分细胞群分析
三种结果不一致	方法假设不同	优先解释多证据支持的机制

十、主要交付物

目标细胞群重新聚类图
pseudotime UMAP
分支和动态基因表
ligand-receptor 通讯表
通讯 circle plot / bubble plot
velocity stream plot
latent time 图
多证据整合候选机制表
可验证候选 ligand、receptor、target gene 清单